Dankzij nieuwe software meer genen bewerken

Op elke gewenste plek in het genoom DNA aanpassen kan met de techniek CRISPR-Cas. Tenminste, als de CRISPR-mechaniek bij de genetische fout kan komen. De meest gebruikte variant van CRISPR kan zo’n tien procent van het DNA bereiken. Wetenschappers van MIT hebben dit bereik weten te verhogen naar bijna vijftig procent.

6 november 2018

Genetische informatie bestaat uit lettercodes of baseparen (C, G, A en T), die je met CRISPR-Cas kunt veranderen. Zo is het mogelijk een genetische fout, waardoor iemand bijvoorbeeld ziek wordt, aan te passen. Hiervoor moet het CRISPR-mechanisme de genetische fout wel kunnen vinden, en dat lukt zeker niet altijd. Dit gaat met behulp van zogenaamd gids-RNA. Dat werkt als een postbode die op zoek gaat naar het juiste postadres, stellen de wetenschappers van het MIT Media Lab in Cambridge. Het gids-RNA is een korte rij baseparen dat zo ontworpen is dat het precies past op de letters van het DNA dat je wilt veranderen. Deze gids is gekoppeld aan een eiwit dat DNA knipt.

Het meest gebruikte eiwit om DNA te knippen is SpCas9. Als het gids-RNA precies past op de DNA-code blijft SpCas9 hier vastzitten en knipt het DNA doormidden. Op deze plek kan vervolgens de breuk in het DNA gerepareerd worden om een nieuw stukje DNA in te bouwen.

SpCas9 kan alleen niet overal binden. Naast dat passende stukje DNA moet áltijd de code ‘GG’ zitten (dit heet de PAM-code), anders kan SpCas9 hier niet vastklikken. Met andere woorden, de postbode gaat op zoek naar zijn adres, maar doorzoekt alleen de postcodes die eindigen op twee G’s (2030 GG, 2130 GG enzovoorts). Op die manier mist de postbode veel adressen. Als je het DNA wilt veranderen op postcode 2030 FG, dan heb je dus een probleem. Als net op die plek een genetisch foutje zit dat voor een ziekte zorgt, kan CRISPR dit niet genezen.

Groter postcodegebied

Hiervoor bedachten de onderzoekers van MIT een oplossing. Ze ontwierpen analysesoftware, genaamd SPAMALOT, om op zoek te gaan naar eiwitten die meer postcodes bezoeken. Op deze manier vonden ze een ‘postbode’ die bezorgt in een gebied met een postcode dat eindigt op één G. Hiermee vergroot je het gebied om het DNA aan te passen. Dit eiwit bleek veel te lijken op de meest gebruikte SpCas9 en heet ScCas9. Het kan bijna de helft van het genoom bereiken. Met ScCas9 is de kans dus veel groter dat je een genetisch defect kunt bereiken dan met SpCas9.

Cas9 gaat met het gids-RNA (grijs) op zoek naar het passende stukje DNA. Wanneer dit past knipt Cas9 het DNA door. Om Cas9 te laten binden moet er direct naast het passende DNA een essentiële code zitten (rood). Voor SpCas9 moet dat eindigen op ‘GG’, voor ScCas9 op ‘G’.
Wikimedia Commons, Marius Walter, bewerkt door Kennislink

Het is een welkome toevoeging aan de gereedschapskist voor CRISPR-Cas. “Het is bijzonder dat er een Cas-eiwit is gevonden dat maar één PAM-letter nodig heeft. Tot nu toe waren het er altijd twee of meer”, zegt Stan Brouns van de TU Delft, die zelf onderzoek doet naar het CRISPR-systeem. “Maar helemaal uniek is het ook niet. Er is een synthetische variant van de welbekende SpCas9, die in het lab zo is aangepast dat deze ook maar één G nodig heeft. Nu is het zaak te bekijken of die natuurlijke ScCas9 beter werkt.”

Het hele postcodegebied

De software kan ook de ‘postcode’ van andere soorten Cas-eiwitten voorspellen. De onderzoekers stellen de software beschikbaar voor vakgenoten. Met deze hulp komen hopelijk meer Cas-eiwitten boven water drijven die weer op andere of grotere postcodegebieden zoeken. Hiermee is dan een nog groter deel van het genoom te bereiken.

Het is nog steeds gewenst om door te blijven zoeken naar andere eiwitten die DNA knippen. “Een Cas-eiwit dat geen enkele PAM-code [in het geval van ScCas9 is dat één ‘G’, red.] nodig heeft is natuurlijk ideaal”, zegt John van der Oost van Wageningen University and Research. “Dat kan wellicht lukken door verschillende Cas-eiwitten te muteren in het lab.”

“Het interessante is dat er ook DNA-knippende eiwitten bestaan die deze eigenschap al van zichzelf hebben.” Dat gaat over de zogenaamde Argonaut-eiwitten, die van nature het gehele postcodegebied doorzoeken. “Wij doen zelf onderzoek naar deze Argonauten, maar het probleem daarbij is dat deze niet heel goed op dubbelstrengs DNA binden”, aldus Van der Oost. Omdat alle organismen hun genetische informatie opslaan in twee strengen DNA die als een trap aan elkaar vastzitten, is het dus belangrijk dat het knip-eiwit hierop kan binden. Van der Oost: “We kunnen dus twee dingen doen: Cas-enzymen zodanig doorontwikkelen dat ze geen PAM-sequentie nodig hebben, of Argonaut-varianten zoeken die wel dubbelstrengs DNA binden.”

Nu het CRISPR-mechanisme met het nieuwe ScCas9 makkelijker op meerdere plekken bindt, zou CRISPR wel eens DNA kunnen aanpassen op een niet gewenste en vooraf geselecteerde plek (de zogenaamde off-targets). “Ik zou inderdaad verwachten dat het minder specifiek wordt”, zegt Brouns. Maar de onderzoekers van MIT concludeerden dat dit nieuwere Cas-enzym juist preciezer is. Het eiwit dat het DNA op meer plekken kan knippen dan de gebruikelijk Cas9 is getest in geïsoleerde menselijke cellen, maar nog niet in het menselijk lichaam.

Bronnen

Chatterjee, P. e.a., Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog, Science Advances (26 oktober 2018)

Reageer